原子力顯微鏡利用針尖與樣品表面原子間的范德華力作為反饋信號(hào),維持針尖樣品間作用力恒定,同時(shí)針尖在樣品表面掃描,從而得知樣品表面的高低起伏。afm原子力顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)與STM相似,原子間作用力的檢測(cè)主要由光杠桿技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。如果探針和樣品之間有力的作用,懸臂將會(huì)彎曲。為檢測(cè)懸臂的微小彎曲量,采用激光照射懸臂的尖部,探測(cè)器就可檢測(cè)出懸臂的偏轉(zhuǎn)。在掃描的同時(shí),通過記錄反饋信號(hào)即可獲得樣品表面的形貌。由于原子力顯微鏡可以在蛋白質(zhì)母液中進(jìn)行掃描,因此是研究蛋白質(zhì)晶體形核、生長、及晶體缺陷的有力手段。、
晶體質(zhì)量越高,通過X射線衍射解析獲得的結(jié)構(gòu)信息也越詳盡、豐富,意義和價(jià)值越大。而高質(zhì)量的晶體就意味著更少的內(nèi)部缺陷,所以對(duì)缺陷進(jìn)行研究,并減少各種缺陷尤為重要。afm原子力顯微鏡對(duì)生物大分子晶體的研究發(fā)現(xiàn)了大多類似無機(jī)物的缺陷,包括零維缺陷,如空位缺陷和替代缺陷;一維缺陷,如位錯(cuò);二維缺陷如堆垛層錯(cuò)和孿晶;三維缺陷,常見的包括微粒的包埋、沉淀和組合。生物大分子晶體對(duì)雜質(zhì)很寬容,允許其結(jié)合。生物大分子晶體缺陷的數(shù)量和密度較大,數(shù)量級(jí)約為小分子晶體的2～4倍,這可能導(dǎo)致晶體的破裂和多晶的形成,進(jìn)而降低晶體質(zhì)量及衍射數(shù)據(jù)的可靠性,甚至阻止晶體生長。生長液的純度是影響蛋白質(zhì)晶體生長重要因素之一。母液中可能有百分之幾的雜質(zhì),這些雜質(zhì)顯著影響晶體的溶解性、生長速度和形態(tài),甚至直接導(dǎo)致晶體的破裂。雜質(zhì)的結(jié)合有助于異質(zhì)形核。在生長過程的早期,蛋白質(zhì)溶液的過飽和度和生長速度都很大,如果雜質(zhì)此階段結(jié)合,很可能不脫離晶體表面。而隨著晶體的生長,生長速度降低,雜質(zhì)的結(jié)合也降低。
應(yīng)用原子力顯微鏡研究雜質(zhì)結(jié)合和晶體質(zhì)量之間的關(guān)系,均得出雜質(zhì)可降低晶體質(zhì)量的結(jié)論。Yoshizaki等發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入5%的雜質(zhì),溶菌酶晶體面變得粗糙,B因子顯著降低;當(dāng)加入10%的雜質(zhì),生長臺(tái)階消失。對(duì)比商業(yè)用和再提純后的溶菌酶晶體的面,發(fā)現(xiàn)前者出現(xiàn)了大量由共價(jià)溶菌酶二聚物才能形成的小顆粒,后者表面平滑,從而得到商業(yè)用晶體質(zhì)量低于再提純晶體的結(jié)論。Plomp等把雜質(zhì)密度較高的母液換為凈化后的母液,發(fā)現(xiàn)生長臺(tái)階很粗糙的刀豆球蛋白晶體的表面雜質(zhì)密度降低,而且螺旋位錯(cuò)附近的螺旋生長臺(tái)階變成帶直邊的多邊形,X衍射分辨率從大于2.8üA提高到2.0ü雜質(zhì)阻止臺(tái)階生長,進(jìn)而導(dǎo)致晶體生長的停止。對(duì)一些大分子和病毒晶體的afm原子力顯微鏡研究表明,此機(jī)制導(dǎo)致了大分子晶體不可挽回的生長停止。若停止生長的小晶體接種到“新鮮”的過飽和溶液,通常不會(huì)長大;然而,如果在接種之前把晶體切片,新鮮表面就會(huì)繼續(xù)生長。原子力顯微鏡觀察結(jié)果表明雜質(zhì)結(jié)合的出現(xiàn)是籽晶播種到“新鮮”溶液時(shí)常失敗的主要原因。這種機(jī)制如何使大分子晶體生長停止呢?當(dāng)一開始,在溶液中形成形核,過飽和度很大,不穩(wěn)定的生長速度很高。只要雜質(zhì)結(jié)合時(shí)間比生長層暴露時(shí)間長,少數(shù)結(jié)合的雜質(zhì)就會(huì)埋入到生長層中。長大的晶體逐漸消耗大分子濃度,溶液的過飽和度降低,生長層的暴露時(shí)間增加,那么,雜質(zhì)的覆蓋面積也就會(huì)增加。
隨著低溫afm原子力顯微鏡,高速原子力顯微鏡,碳納米管探針等技術(shù)的發(fā)展,afm原子力顯微鏡的分辨率和動(dòng)力學(xué)性能將進(jìn)一步提高,未來的研究可能集中在以下幾個(gè)方面:
①繼續(xù)晶體生長機(jī)制研究,包括分子間相互作用機(jī)制研究,如蛋白質(zhì)和DNA、蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)和固體襯底間的相互作用,以及在各種襯底上生物大分子納米結(jié)構(gòu)的吸附,而這正是生物材料、生物加工、生物薄膜研究的基礎(chǔ);
②缺陷的深入研究及相關(guān)理論的發(fā)展,為提高晶體質(zhì)量提供理論指導(dǎo);
③對(duì)X射線衍射解析晶體結(jié)構(gòu)的輔助作用,例如可以觀察到單個(gè)分子,其精細(xì)結(jié)構(gòu)有助于結(jié)構(gòu)模型的構(gòu)建,而單層生長臺(tái)階的高度,則提供給我們分子尺寸的精確信息。